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傷寒Vi多糖柱層析純化工藝的優化

擇要

目標:優化傷寒Vi 多糖柱層析純化工藝,以替換傳統苯酚抽提、乙醇分級積淀法。體例:接納DEAE 離子互換層析柱,別離在緩沖液(20 mmol/L Tris-ClpH 值為6. 07. 0 8. 0 的前提下純化1 批傷寒Vi 多糖粗糖,并與傳統苯酚抽提、乙醇分級積淀法停止比擬。按《中國藥典》三部(2010 版)請求檢測純化樣品的卵白質含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨細及內毒素含量,并計較樣品的多糖收受接管率。接納優化的DEAE 柱層析純化工藝純化3 批傷寒Vi 多糖粗糖,考證該工藝的不變性。成果DEAE 離子互換柱緩沖液(20 mmol /L Tris-ClpH 值為7. 0 8. 0 時,可有用將傷寒Vi 多糖的雜質與純化產物分手,多糖收受接管率別離為36. 52% 38. 35%,較著高于傳統工藝的多糖收受接管率(15. 52%),且純化產物的內毒素含量(10 EU /μg)較著低于傳統工藝(200 EU/μg)。以優化工藝(pH 7. 0)純化3 批傷寒Vi 多糖粗糖取得的6 批精糖的卵白質含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨細、內毒素含量及多糖收受接管率差別較小,規范誤差均小于5%。論斷優化了傷寒Vi 多糖柱層析的純化工藝,該工藝不變性杰出,可替換傳統苯酚抽提、乙醇分級積淀法,利用于傷寒Vi 多糖的純化。
 
傷寒是由傷寒梵衲桿菌引發的一種急性腸道沾抱病,該病經腸道沾染網狀內皮細胞體系、腸道淋巴體系和膽囊而致急性滿身性沾染。我國自1998 年洪澇災難后,傷寒病發率慢慢下降。據2008 年中國衛生部統計,傷寒或副傷寒的沾染率為118/10 萬,病死率約為0. 04 / 10 萬,該病是中國病發率前十位的沾抱病之一[1]。WHO 保舉利用傷寒Vi 多糖疫苗防備傷寒的風行2。研討標明,大范圍的利用傷寒Vi 多糖疫苗,可較著下降傷寒的風行,加重社會的經濟承擔3-4
傷寒Vi 多糖的有用抗原為細胞壁外的莢膜多糖。傳統純化工藝多接納苯酚抽提、乙醇分級積淀等體例,該體例所利用的提取試劑對情況凈化嚴峻,工藝的煩瑣致使多糖收受接管率偏低。本嘗試對純化前提暖和的DEAE 陰離子互換層析法的pH 值停止了闡發比擬,成立一種步驟簡略、純化成果好、情況凈化小的傷寒Vi 多糖柱層析純化工藝,并對該體例的不變性停止考證,以替換傳統苯酚抽提、乙醇分級積淀法,利用于傷寒Vi 多糖的純化。
1 資料及體例
1. 1 樣品4 批傷寒Vi 多糖粗糖(批號為STVi20111206STVi 20111207STVi 20120101 STVi20120102)由本公司發酵研討室供給。
1. 2 首要試劑及儀器Tris-Cl 和氯化鈉購自國藥團體化學試劑無限公司;AKTA explorer 層析體系、DEAE 層析填料和XK26/20 層析柱均購自GE 公司。
1. 3 DEAE柱層析純化接納AKTA exploere 層析體系,DEAE 填料柱體積為45 ml,用20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)緩沖液充實均衡DEAE柱。稱取傷寒Vi 多糖粗糖(STVi 20111206300 mg,按5 mg/ml 消融于20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)緩沖液中,經0. 45 μm 濾膜過濾后,按每毫升填料5 ~ 10 mg 樣品上樣于預處置好的DEAE 層析柱,流速為3 ~ 6 ml/min,用緩沖液A20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)]淋洗4 ~5 倍柱體積,用緩沖液B20 mmol/L Tris-Cl +0. 5 mol/L NaClpH 6. 07. 0 8. 0)]停止10 ~15倍柱體積的持續梯度洗脫。純化進程別離用紫外206260280 nm 波長檢測多糖、核酸及卵白含量。搜集穿透峰,除菌過濾后用打針用水透析48 h,置真空枯燥,用于后續檢測。
1. 4 傳統工藝純化參考《中國藥典》三部(2010 版)5傷寒Vi 多糖疫苗)的體例純化傷寒Vi 多糖粗糖(STVi20111206)。
1. 5 純化樣品的檢測取適當純化產物,用打針用水消融,根據《中國藥典》三部(2010 版)5對純化產物的卵白質含量(應小于10 mg/g)、核酸含量(應小于20 mg/g)、O-乙酰基含量(應不低于2. 0 mmol/g)、份子巨細(多糖份子的KD 值在0. 25 之前的洗脫液多糖收受接管率應在50%以上)及內毒素含量停止檢測,并停止覽辨別嘗試(Vi 多糖與傷寒Vi 血清發生較著積淀線)。按下式計較多糖收受接管率。
多糖收受接管率(%= 精糖的收量(g/粗糖的投量(g)× 100%
1. 6 DEAE柱層析不變性的檢測接納優化的DEAE柱層析工藝純化3 批傷寒Vi 多糖粗糖(STVi 2011-1207STVi 20120101 STVi 20120102),并對純化產物停止相干名目標檢測,計較規范差(SD)和變異系數(CV),考證該工藝的不變性。
2 成果
2. 1 DEAE 柱層析純化檢測成果可見,上樣緩沖液為pH 6. 0 20 mmol/L Tris-Cl 時,目標產物流穿,但核酸和雜卵白未連系在層析柱上,隨穿透峰一起穿出;上樣緩沖液為pH 7. 0 20 mmol/LTris-Cl 時,目標產物流穿,核酸和雜卵白連系于層析柱上,并隨緩沖液B 梯度的增添慢慢被洗脫上去;上樣緩沖液為pH 8. 0 20 mmol/L Tris-Cl 時,純化成果與pH 7. 0前提下類似,見圖1
2. 2 純化樣品的判定檢測成果標明,DEAE 柱層析純化緩沖液pH 值為6. 0 時沒法有用去除傷寒Vi多糖中的雜卵白及核酸,其純化產物的卵白質含量是pH 7. 0 pH 8. 0 前提下的17. 86 15. 37 倍,核酸含量是pH 7. 0 pH 8. 0 前提下的5. 25 6. 06倍,內毒素含量遠低于傳統工藝,僅為傳統工藝的5%。見表1。傳統工藝純化多糖收受接管率為15%,而DEAE 柱層析工藝(pH 7. 0 pH 8. 0)純化多糖收受接管率別離為36. 52%和38. 35%,見表2。因為傷寒Vi 多糖中含O-乙酰基,在堿性前提下O-乙酰基易零落,是以,本嘗試挑選pH 7. 0 為層析純化的最好前提。
2. 3 DEAE 柱層析的不變性檢測成果標明,以優化工藝純化3 批傷寒Vi 多糖粗糖取得的6 批精糖的卵白質含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨細、內毒素含量及多糖收受接管率差別較小,規范誤差均小于5%。標明該體例具備杰出的不變性。見表3 和表4
 
 
3 會商
凡是在離子互換層析中,pH、離子強度等前提是純化成果的關頭身分,本嘗試接納DEAE 柱層析純化多糖是使純化產物經層析柱后流穿,雜質連系于層析柱上,是以,離子強度對該純化體例無主要影響。本嘗試重點是對層析柱的pH 值停止了優化。
嘗試成果標明,在緩沖液(20 mmol/L Tris-ClpH 6. 0 前提下未能將目標產物與雜質分手,在pH 7. 08. 0 前提下多糖流穿,大局部核酸及卵白等雜質連系于層析柱上,并隨緩沖液B 梯度的增添而被慢慢洗脫上去,因為傷寒Vi 多糖中含O-乙酰基,在堿性前提下O-乙酰基易零落,是以,挑選pH 7. 0 作為傷寒Vi 多糖的最好柱層析純化前提。
為防止疫苗出產進程中苯酚等有毒化學試劑及高濃度乙醇、甲醇等易燃易爆的無機溶劑對疫苗品質的影響6-7,接納古代純化手藝對傳統的出產工藝停止改良,削減或棄用有毒化學試劑,以進步疫苗產物品質。Pato 8切磋了流腦C 群莢膜多糖的柱層析純化工藝,國際也報道層析法對流腦A 群莢膜多糖去雜卵白的有用性9
傷寒Vi 多糖疫苗的有用抗原局部為莢膜多糖,凡是提取莢膜多糖的體例是以Gotschlich 法為根本10,傳統傷寒Vi 多糖的提取工藝多接納苯酚抽提、乙醇分級積淀等體例5-6,11,但苯酚為有毒化學試劑,為該疫苗的利用帶來必然的寧靜隱患,是以,本嘗試經由過程接納DEAE 離子互換層析,肯定了緩沖液20 mmol/LTris-Cl pH 7. 0 DEAE 層析柱工藝的最好前提,中性pH 值確保了多糖布局的不變性,進步了純化產物的品質目標,且較著下降了純化產物的內毒素含量。
本嘗試接納優化的DEAE 柱層析工藝對3 批粗糖停止了純化,嘗試成果顯現,所獲得的6 批精糖品質均合適劃定,卵白質含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨細、內毒素含量及多糖收受接管率差別較小,規范誤差均小于5%,標明該工藝具備杰出的不變性,易于工藝縮小,進步了疫苗的寧靜性及產物的品質規范,可替換傳統苯酚抽提、乙醇分級積淀法,利用于傷寒Vi 多糖的純化。
 
 
參考文獻
[1] 王江,劉慶云,謝崢,等. 傷寒疫苗的研討停頓[J]. 微生物學免疫學停頓,2010,38(2):70-74.
[2] WHO. Typhoid vaccines:WHO position paper[J]. Wkly Epidemiol Rec,2008,83(6):49-59.
[3] Khan MI,Ochiai RL,Clemens JD. Population impact of Vi capsular polysaccharide vaccine[J]. Expert Rev Vaccines,2010,9(5):485-496.
[4] Schwartz E. A cluster-randomized effectiveness trial of Vi typhoid vaccine in India[J]. N Engl J Med,2009,361(22):2191-2192.
[5] 國度藥典委員會. 中華國民共和國藥典(三部)[S]. 北京:中國醫藥科技出書社,2010:38-40
[6] Kothari S,Kothari N,Lee E,et al. Development of an efficient and scalable method for processing and purification of Vicapsular polysaccharide[J]. Procedia Vaccinol,2010,2(1):78-81.
[7] Hamidi A,Beurret MF. Process for producing a capsular polysaccharide for use in conjugate vaccines[P]:USA,US Patent Application 20070065460,2007-03-22.
[8] Pato TP,Barbosa Ade P,Da Silva Junior JG. Purification of capsular polysaccharide from Neisseria meningitidis serogroup Cby liquid chromatography [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2006,832(2):262-267.
[9] 解紅艷,王濟源,劉靜,等. 層析法去除A 群流腦多糖疫苗粗糖中雜卵白[J]. 中國生物工程雜志,2010,30(8):88-92.
[10] Gotschlich EC,Liu TY,Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus III. Preparation and immunochemical properties of the group A,group B,and group C meningococcal polysaccharides[J]. J Exp Med,1969,129(6):1349-1365.
[11] 朱為,榮家康,江元翔,等. A 群和C 群腦膜炎球菌莢膜多糖提制工藝研討[J]. 藥物生物手藝,2011,18(1):56-60.
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